Under första dagen av laboration har vi gått genom bakteriell lysering, Rening process av Rekombinant plasmid (LL37) och DNA koncentration bestämning.

 

Nedan är svaren på frågorna:

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

 

Förhoppningsvis hela Bakteriell innehåll utan Rekombinant plamid har tagit bort ( Bakteriell cell vägg och cell membrans Proein ,Chromosomal DNA and RNA). mha SDS och alkalisk denaturering, båda chromosomal DNA och protein ska denatureras men inte DNA plasmid tack vara supercoil egenskaper av plasmid. After neutralizering, chromosomal DNA misslyckas att återbinda vätebindningarna mellan baserna.  Centrifugering hamnar protein, chromosomal DNA och cell debris i pelleten. RNase degrederar RNA.Till sist spin column binder DNA starkare än RNA tack vara starka negativa laddningar av ds-DNA.

 

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Vi kan inte vara säker att vi har fått ett Rent DNA. Kontaminering med protein, chromosomal DNA och RNA är möjligt. Det finns 2 metoder för att testa renhet av rekombinant Plamid DNA. Först att läsa DNA absorbans vid 260 nm och 280 nm med hjälp av Spektrofotometer. Om kvoten för absorbans vid Ab260/ Ab280 är lika med 1,8 det betyder att vi har fått DNA som inte innehåller kontaminering med proteiner.

 I vårt fall fick vi 1,678 och det betyder att DNA är kontaminerad med protein. Orsaken till det kan vara kontaminering av supernatant - som vi hade fått after neutralization- med pelleten.

 

 

 

 

 

Fig. 1 Ab vid 260nm = (0.074)

 

Den andra metoden är agaros Elktrofores. Kontaminering med RNA eller chromosomal DNA kan detekteras. RNA som (smear) längst ner i gelen och DNA som band på olika storlek.

 

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

 Jag har inte kommit på något under första labb.