Dag 3 och 4. Noha F.

Dag 3och 4 : Resultat på PCR med gelelektrofores och Southern Blot.

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

 Bilderna nedan visar upp en elektrofores bild på PCR produkt jämförelse med southern blot:

                                                                                                                    

                        Klyvid                 oklyvid
     MΙΙΙ       0.5    0.005   MIX     Plasmid                                              

 

                                                                              

 

 

 

 

 

PCR produkter (från vänster till höger): Markören MΙΙΙ, Två späddlösningen på PCR produckt LL37, 0.5 μg och 0.005 μg, Markör MIX  samt oklyved plamid.

Brunnen -2- som innehåller 0.5 μg klyvd plasmid visar upp två tydliga band, LL37 ligger längst ner (ca 615 bp) och ett plasmid band (open circular) som ligger ovanför ll37 band. På  Southern blott metod, proben som har komplementär sekvens till ll37 genen kommer att binda specific med ll37 gen och därför bilden på southren blott visar upp ett band bara.

 

Brunnen -3- som innehåller 0.005 μg klyvd plasmid visar inget band. Det är förväntad resultat eftersom gel separation är concentration beroende. Hög späddningen på genen kan inte detekteras. Southern blott är känsligare metod tack vara proben som har hög aktivitet för att detekteras en liten mängd av ”Membrane bound DNA” så att bandet som var svårt och ser på elektrofores kan detekteras after hybidization med inmärked proben.

 

Sista brunnen innehåller oklyvd plasmid DNA  uppstår som ett stark band. Ovanför detta band finns några tunna band represent supercoil plasmid som separerar i gelen i olika band beror på sina olika formen.dessa band blev tydligare på southern blott metod .

 

PCR metod är lättare, känsligare (utföra med liten mängd av templat) och tar kortare tid än Southern blott  men också med stort risk av ”carry over contamination”. Southern blott är en krånglig metod som behöver många lab. Instrument och reagener, vissa av dem är farliga (carcinogen) men känsligare att detektera genen med hög späddningen.

  

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Det som jag har lärt mig att kopla ihop den teoriska information med praktiska delen coh tolka icke typiska resultaten.

 

Dag 2 Kontroll elektrofores, Noha f.

Dag-2- Kontroll elektrofores på PCR och plasmid Prep.

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Bilden på Elektrofores agarose gel visar att vi har fått bra resultat. PCR Produk detekterades som ett skarpt band precise som den positiva kontrollen (innhåller känd LL37-gen). Båda band ligger på samma nivå i agarose gel som starka band. PCR negativ kontroll visar inget band på gel electrofores. Det betyder att vårt prov innehåller LL37 gen -som ampliferad med PCR- och bandet som vi har fått är inte på grund av ”Carry over contamination” ex: från mikropippet.

 

Plasmid Prepation visar ett skarp band på agrose gel. Kontamination med RNA- som har mindre storlek än plasmid och uppstår som ”smear” längst ner i gelen- detekterades inte . Kontamination med kromosomal DNA -som har större storlek än plasmid- detekterades inte. Det betyder att vi lyckadas att få bort kromosomal DNA och RNA från plasmid preparation. I stället, har vi fått svagt band precise ovan plamiden. Detta svagt band kan vara ”open circular DNA”.

    

      +ve         -ve           M        PCR        Plasmid

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Vi lyckades att få bra resultat.

 

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Jag tänker om det är möjligt att beräkna och diskutera alla beräkningen med lärare innan vi börjar köra laboration.

 

 

Under första dagen av laboration har vi gått genom bakteriell lysering, Rening process av Rekombinant plasmid (LL37) och DNA koncentration bestämning.

 

Nedan är svaren på frågorna:

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

 

Förhoppningsvis hela Bakteriell innehåll utan Rekombinant plamid har tagit bort ( Bakteriell cell vägg och cell membrans Proein ,Chromosomal DNA and RNA). mha SDS och alkalisk denaturering, båda chromosomal DNA och protein ska denatureras men inte DNA plasmid tack vara supercoil egenskaper av plasmid. After neutralizering, chromosomal DNA misslyckas att återbinda vätebindningarna mellan baserna.  Centrifugering hamnar protein, chromosomal DNA och cell debris i pelleten. RNase degrederar RNA.Till sist spin column binder DNA starkare än RNA tack vara starka negativa laddningar av ds-DNA.

 

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Vi kan inte vara säker att vi har fått ett Rent DNA. Kontaminering med protein, chromosomal DNA och RNA är möjligt. Det finns 2 metoder för att testa renhet av rekombinant Plamid DNA. Först att läsa DNA absorbans vid 260 nm och 280 nm med hjälp av Spektrofotometer. Om kvoten för absorbans vid Ab260/ Ab280 är lika med 1,8 det betyder att vi har fått DNA som inte innehåller kontaminering med proteiner.

 I vårt fall fick vi 1,678 och det betyder att DNA är kontaminerad med protein. Orsaken till det kan vara kontaminering av supernatant - som vi hade fått after neutralization- med pelleten.

 

 

 

 

 

Fig. 1 Ab vid 260nm = (0.074)

 

Den andra metoden är agaros Elktrofores. Kontaminering med RNA eller chromosomal DNA kan detekteras. RNA som (smear) längst ner i gelen och DNA som band på olika storlek.

 

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

 Jag har inte kommit på något under första labb.

Noha F. grupp 2 LL37-Dag1.

Under första dagen av laboration har vi gått genom bakteriell lysering, Rening process av Rekombinant plasmid (LL37) och DNA koncentration bestämning.

 Nedan är svaren på frågorna:

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

 
Förhoppningsvis, hela Bakteriell innehåll utan Rekombinant plamid har tagit bort ( Bakteriell cell vägg och cell membrans Proein ,Chromosomal DNA and RNA). mha SDS och alkalisk denaturering, båda kromosomal DNA och proteiner ska denatureras men inte DNA plasmid tack vara supercoil egenskaper av plasmid. After neutralizering, chromosomal DNA misslyckas att återbinda vätebindningarna mellan baserna.  Centrifugering hamnar protein, kromosomal DNA och cell debris i pelleten. RNase degrederar RNA. Till sista Spin column binder DNA mycket starkare än RNA på grund av starka negativa läddning av ds-DNA.

 

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Vi kan inte vara säker att vi har fått ett Rent DNA. Kontaminering med protein, chromosomal DNA och RNA är möjligt. Det finns 2 metoder för att testa renhet av rekombinant Plamid DNA. Först att läsa DNA absorbans vid 260 nm och 280 nm med hjälp av Spektrofotometer. Om kvoten av absorbans vid Ab260/ Ab280 är lika med 1,8 det betyder att vi har fått DNA som inte innehåller kontaminering med proteiner.

 I vårt fall fick vi 1,678 och det betyder att DNA är kontaminerad med protein. Orsaken till det kan vara kontaminering av supernatant - som vi hade fått after neutralization- med pelleten.

 

                                 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                               

Fig (1) Ab vid 260nm = (0.074)

Den andra metoden är agaros Elktrofores. Kontaminering med RNA eller chromosomal DNA kan detekteras. RNA som (smear) längst ner i gelen och DNA som band på olika storlek.

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

 Nej.

test